キャラクター
ルイージ
世界一有名なゲームキャラクター、マリオの弟。兄の存在が大きすぎるのでやや影が薄いが、マリオシリーズで初の主役を務めることとなった前作に引き続き、今作でも主役。前作では、お化けを背負ったオバキュームで吸い込みながら行方不明のマリオを探すが、兄と比べて弱気で怖がりなので、おっかなびっくりびっくりで屋敷を探索する。怖さを紛らわすためかゲーム中では鼻唄を歌っていた。
マリオ
言わずと知れた誰もが知っている有名人。ルイージの兄。
ルイージが主役の作品のため前作では出番はほとんどなかったが今作ではどうなるのだろうか？
オヤ・マー博士
一風変わった話し方をするというオバケ学の権威。
平和なオバ渓谷を取り戻すためにルイージを無理やり？呼び寄せてルイージに助けを請う。安全な研究室からだが、自慢の発明品の数々を使ってルイージをサポートするという。
キノピオ
おなじみキノコ王国の住民。ルイージの手助けを色々としてくれる。
オバ犬
ルイージの周りに現れる犬のオバケ。オバケの犬かもしれない。敵なのか味方なのかはっきりしないようだ。
テレサ
マリオシリーズおなじみの敵。白い可愛らしい姿をしていて、プレイヤーキャラに見つめられると恥ずかしがって動きが止まってしまうが、見ていない間にこっそり近づいてくる。他の作品では、他の敵キャラと並ぶ、いちキャラクターでしかないが、敵のほとんどがお化けの今作では相対的に存在感がある。
キングテレサ
テレサたちの親玉。悪そうな顔をしていて、ダークムーンを壊した物語の元凶。
やはりラスボスはこのキングテレサなのか？
その他のオバケ
ルノーマ、ルブリー、ルハイド、ルゴーバなどといった、他のマリオシリーズでは見られない、ルイージマンション独自の敵キャラが存在する。
オバケは各色ごとに特徴を持っている。